- 用于臨床體外診斷（膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學發(fā)光法）；
- 用于生物醫(yī)藥研發(fā)（基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā)）
- 用于腫瘤研究、免疫學研究等基礎研究；申請具有自主知識產(chǎn)權的發(fā)明專利及科研獎項；
- 拓展研究思路、發(fā)表國際知名學術刊物。
- 羊駝/駱駝背景清晰：羊駝/駱駝健康適齡，可提供空白羊駝/駱駝進行免疫。
- 技術成熟：抗體庫容量可以達到109,VHH抗體片段有效插入率﹥99%，并可以進行高通量篩選。
- 大規(guī)模制備：可利用原核/真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)克級以上的抗體診斷原料。
| 步驟 | 周期 | 交付材料 |
| 1.動物免疫 | ||
| A.5次動物免疫 B.效價檢測 C.PBMC分離 D.RNA提取 E.cDNA制備 |
92天 | 5次免疫效價檢測數(shù)據(jù) 5次免疫之后的cDNA |
| 2.構建噬菌體抗體庫 | ||
| A.利用免疫羊駝的cDNA，擴增出VHH基因片段，構建M13單鏈絲狀噬菌體展示納米抗體免疫文庫; B.抗體庫質(zhì)量： （1）VHH抗體片段有效插入率﹥99%， （2）抗體庫容量達到109 C.從文庫中隨機挑取96個克隆，對其中30個克隆測序，分析VHH抗體片段的多樣性和正確率，保證正確率≥80%，另外提供30個克隆用于測序驗證； |
4-6周 | 提供質(zhì)檢報告與抗體庫 ①完整的項目報告和原始數(shù)據(jù)，報告需包含實驗流程、分析評估實驗的主要 操作步驟、以及詳細的實驗結(jié)果； ②共30個文庫隨機克隆的甘油菌和測序引物； ③噬菌體展示納米抗體免疫文庫的Kit（包含文庫甘油菌1ml × 10支和文庫噬菌粒質(zhì)粒10 μg）； |
| 3.抗體庫篩選 | ||
| A.篩選方案確定：根據(jù)項目實際情況，選擇不同的篩選方案，如競爭篩選，固相篩選，液相篩選，細胞篩選，負篩選等篩選方法。 B.淘選： 對抗原蛋白進行SDS-PAGE分析驗證，并進行生物素標記；針對生物素化靶點蛋白，利用鏈霉親和素預包被的ELISA plates，淘篩免疫文庫；抗原施壓法進行2-3輪淘篩，確定充分富集且靶點篩選組的滴度要遠高于對照篩選組。 C.結(jié)合篩選：選擇從Output克隆中，分別挑取940個單克隆進行陽性克隆鑒定。經(jīng)培養(yǎng)和phage rescue后，進行monoclonal phage ELISA檢測。 D.測序分析:鑒定出抗原結(jié)合強陽性的VHH抗體克隆，測序分析，比對序列制作進化樹，選擇序列獨特的克?。?br> E.表達驗證：少量表達陽性VHH克隆，利用soluble ELISA檢測對靶點抗原的特異性結(jié)合能力； |
6-8周 | 10個以上的特異性克隆 |
| 4.納米抗體表達純化 | ||
| A.將納米抗體基因克隆至真核或原核表達載體。 | 2周 | 高純度納米抗體100-500ug |
| 5.親和力測定 | ||
| 采用Biacore 測定抗體的親和力/ 采用Nicoya LSPR 測定抗體的親和力/ 采用Fortebio octet 測定抗體的親和力 |
1周 1周 1周 |
親和力測定數(shù)據(jù) |
| 6.納米抗體人源化（通過自主開發(fā)軟件AbsYs分析抗體可變區(qū)并進行抗體人源化設計。） | ||
| A.識別FR、CDR、關鍵殘基、PTMs。 B.通過同源比對，考慮可變區(qū)一致性及相似性、關 鍵殘基、PTMs、穩(wěn)定性等因素，選擇更好的人源抗 體Germline FR作為模板，與羊駝CDR 重組，設計初 始人源化抗體。 C.分析抗體序列和結(jié)構，確定需要回復突變的關鍵 殘基，設計不同數(shù)量的回復突變VH。 D.將人源化基因克隆至真核表達載體，轉(zhuǎn)染293瞬時 表達獲得100-500ug 純化抗體。 E.結(jié)合活性及親和力檢測。 |
6-8周 | 至少一個人源化抗體（親和力、表達量與原納米抗體相當） |
本項目共免疫2只羊駝， 經(jīng)過5次免疫后檢測抗血清效價，結(jié)果顯示，A, B-1（Fc tag）蛋白免疫動物后均產(chǎn)生了正常的免疫應答。重鏈抗體的效價較總IgG的效價低，4免后效價達到最高，建議結(jié)束免疫階段實驗，進入建庫篩選階段。