CRISPR/Cas12結(jié)合反向斑點雜交技術(shù)進行可視化多重靶標檢測
- 2023 - 12 - 19
作者在CRISPR-RDB體系中采用了Cas12a，利用Cas12a在靶標識別后表現(xiàn)出的針對非特異單鏈DNA的反式剪切活性實現(xiàn)多重檢測。首先，作者設(shè)計了四條序列不同的Biotin-recognition DNA（recDNA I、II、III和IV），及其相應(yīng)的序列互補的捕獲DNA（capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ）。recDNA I、II、III和IV分別與識別不同靶標序列的Cas12a/crRNA復(fù)合物孵育，形成單獨的反應(yīng)單元。將待測樣本分別加入這4個反應(yīng)單元，在對應(yīng)靶標存在的情況下，Cas12a被激活并反式剪切recDNA；在對應(yīng)靶標不存在的情況下，Cas12a不會被反式激活，相應(yīng)的recDNA保持完整。反應(yīng)結(jié)束后，將4個反應(yīng)單元的產(chǎn)物混合，并與尼龍膜上包被的capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ孵育，完整的recDNA能與對應(yīng)的capDNA互補結(jié)合，從而引入Biotin標記。Biotin標記的recDNA：capDNA雙鏈可以結(jié)合streptavidin-HRP，將無色的TMB底物轉(zhuǎn)化為藍色。因此，藍色指示對應(yīng)靶標不存在；而白色指示對應(yīng)靶標存在，且recDNA全部被反式剪切。
02、CRISPR-RDB的可行性分析
為了驗證CRISPR-RDB體系的可行性，作者先將4種recDNA和4種capDNA雜交，結(jié)果表明每條帶有4種capDNA的尼龍膜可識別到對應(yīng)的recDNA，且recDNA I、II、III和IV之間沒有干擾。 同時，作者測試了4個具有不同靶標序列識別能力的Cas12a/crRNA系統(tǒng)，顯示能夠在特異靶標存在的情況下剪切對應(yīng)的recDNA。
接下來，為了進行臨床檢測探索，作者將4重靶標分別設(shè)置為甲型流感病毒（FA）、乙型流感病毒（FB）、呼吸道合胞病毒（RSV）和嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的部分序列，并搭建了簡易的4通道微流控芯片。隨后，作者模擬了FA、FB、RSV、SARS-CoV-2這4種靶標序列的多種可能性組合（包括同時存在0種，1種，2種，3種，甚至4種靶標），結(jié)果表明CRISPR-RDB體系能夠檢測到以上所有組合情況。而且，使用智能手機應(yīng)用程序?qū)Σ煌瑵舛鹊陌袠薉NA（0、5、10、30 nM）進行藍點顏色識別，可以觀察到靶標濃度與藍點的顏色深淺呈反比，由此可以進行靶標濃度的相對定量。
03、CRISPR-RDB關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
為了提升CRISPR-RDB體系的檢測性能，作者對其中的關(guān)鍵因素進行了優(yōu)化，確認尼龍膜承載體積（每個正方形尺寸為0.5 cm×0.6 cm）為1 μL；capDNA（1 μL，10 μM）和recDNA（75 nM）之間雜交條件為35℃，40 min；Cas12a濃度對為100 nM；HRP孵育時間為20 min。
04、CRISPR-RDB檢測性能
在上述優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)條件下，作者進一步測試了CRISPR-RDB體系的檢測性能。作者采用RPA預(yù)擴增的方案進行靶標富集，隨后用CRISPR-RDB體系對靶標濃度進行相對定量。如圖展示了針對4種靶標病毒的RPA引物和crRNA設(shè)計方案。隨后，對不同濃度（0、2.5、5、10、15、20 nM）靶標DNA進行檢測，隨著各靶標DNA濃度的增加，4個通道中的藍點強度相應(yīng)地逐漸變?nèi)?。使用智能手機應(yīng)用程序?qū)σ幌盗邪袠薉NA濃度進行相對量化，結(jié)果顯示在2.5–20 nM范圍內(nèi)具有良好的線性。進一步評估CRISPR-RDB對真實病毒樣品的檢測靈敏度，結(jié)果顯示對不同濃度（0、2、4、6、8、10和100個拷貝）FA、FA、RSV和SARS-CoV-2樣本有梯度檢測結(jié)果，且檢測限低至4個拷貝/μL。
為了測試CRISPR-RDB檢測體系的特異性，作者首先證明4種病毒靶標都可以被對應(yīng)的Cas12a/crRNA特異識別，具有較高的選擇性；進一步地，作者在靶標序列中引入2個突變堿基后，結(jié)果表明2個位點錯配會導(dǎo)致Cas12a反式剪切活性的顯著降低，說明CRISPR-RDB檢測體系具有較高的特異性。此外，作者還測試了藍點在尼龍膜上的顯色穩(wěn)定性，結(jié)果表明4°C比25°C、37°C更有利于藍點顏色的穩(wěn)定保存，這可能與單鏈DNA在較高的溫度更容易降解有關(guān)。因此，確認尼龍膜顯色最佳存儲條件為4°C下不超過10天，25°C下不超過3天。
05、CRISPR-RDB的臨床應(yīng)用
為了探索CRISPR-RDB在真實臨床樣本中的應(yīng)用，作者展示了工作流程圖。其從樣本到檢測結(jié)果的時長大約為105 min，檢測信號可以通過智能手機應(yīng)用程序或肉眼來讀取。對23個臨床樣本進行檢測（1號：陰性對照；2–6號：FA陽性樣本；7–11號：FB陽性樣本；12–16號：新冠病毒陽性樣本；17–23號：呼吸道合胞病毒陽性樣本），并將檢測結(jié)果與qPCR對比，結(jié)果顯示，除19號樣本外，其它臨床樣本檢測結(jié)果一致。
隨后，作者使用含有FA、FB、RSV和SARS-CoV-2真實樣本的隨機混合來評估多通道性能（第1號：陰性對照；第2–7號：含有兩種病毒的樣本；第8–11號：含有三種病毒的樣本；第12號：含有四種病毒的樣本），結(jié)果顯示CRISPR-RDB對單個或多個混合靶標都表現(xiàn)出高靈敏度和特異性，證明了其在多重核酸檢測領(lǐng)域的潛力。
高危HPV的持續(xù)感染會導(dǎo)致全球女性第二常見的惡性腫瘤，侵襲性子宮頸癌的主要高危HPV基因型為HPV 16、18、31、33、35、45、52和58。目前，PCR-RDB作為一種常見的診斷方法已被廣泛應(yīng)用于HPV類型的精確鑒定。作者基于CRISPR-RDB策略，構(gòu)建了針對高致病性類型HPV 16、18、52和58的4通道診斷方法。該方法不僅比傳統(tǒng)的PCR-RDB更加省時（105 minVS PCR-RDB的290 min），而且所需的儀器也非常簡單。為了驗證其多重核酸診斷性能，作者優(yōu)先使用商業(yè)PCR-RDB試劑盒測試了5個樣本，隨后使用CRISPR-RDB平臺對確認的臨床樣本進行測試，獲得了與PCR-RDB一致的檢測結(jié)果。這充分說明了CRISPR-RDB作為一個平臺型檢測策略應(yīng)用于多重核酸檢測的巨大潛力。
總的來說，CRISPR-RDB平臺可通過使用掌心型微流控芯片和尼龍膜進行可視化信號讀出，且能用于同時檢測多重核酸靶標。與金標準qPCR進行比較，CRISPR-RDB平臺顯示出對臨床樣本高度一致的檢測結(jié)果；與PCR-RDB相比，其檢測時間節(jié)省了2/3。因此，CRISPR-RDB平臺可能在未來為多重核酸檢測提供一種簡單、通用、經(jīng)濟高效的解決方案。
參考文獻：Hu T, Ke X, Li W, Lin Y, Liang A, Ou Y, Chen C. CRISPR/Cas12a-Enabled Multiplex Biosensing Strategy Via an Affordable and Visual Nylon Membrane Readout.Adv Sci (Weinh). 2023 Jan;10(2):e2204689. doi: 10.1002/advs. 202204689. Epub 2022 Nov 28. PMID: 36442853; PMCID: PMC9839848.